產(chǎn)品編號：BS1001 參考價格：48次 2400元
產(chǎn)品特點：采用精準(zhǔn)的探針法熒光定量檢測，確保準(zhǔn)確性；本試劑盒采用實時熒光PCR方法檢測牛、羊、豬、馬等牲畜的乳腺、淋巴結(jié)等組織病料和陰道分泌物、精液等液體病料中的布氏桿菌（BS）。適用于布氏桿菌感染的輔助診斷。試劑盒為預(yù)混體系，此體系包含熒光 PCR 檢測所需的核酸擴增酶、反應(yīng) buffer 及特異性引物和探針，加入提取的樣品 DNA 并補足 20 μL 體積的水后即可直接進行熒光 PCR 檢測。
產(chǎn)品特點：采用精準(zhǔn)的探針法熒光定量檢測，確保準(zhǔn)確性；
布氏桿菌熒光 PCR 檢測試劑盒
使用說明書
用途
本試劑盒采用實時熒光PCR方法檢測牛、羊、豬、馬等牲畜的乳腺、淋巴結(jié)等組織病料和陰道分泌物、精液等液體病料中的布氏桿菌（BS）。適用于布氏桿菌感染的輔助診斷。試劑盒為預(yù)混體系，此體系包含熒光 PCR 檢測所需的核酸擴增酶、反應(yīng) buffer 及特異性引物和探針，加入提取的樣品 DNA 并補足 20 μL 體積的水后即可直接進行熒光 PCR 檢測。
原理
在Taq 酶的作用下，經(jīng)高溫變性、中溫退火及延伸的循環(huán)，使特異 DNA 片段的拷貝數(shù)放大，經(jīng)熒光素標(biāo)記的探針與擴增的 DNA雜交，利用 Taq 聚合酶的 5'→3'外切活性，使熒光探針的報告基團與淬滅基團分離，發(fā)出特異性熒光信號，利用熒光 PCR 儀檢測特異性熒光信號，根據(jù)樣品 Ct 值的大小及擴增曲線的形成情況判定結(jié)果。
儲存條件及有效期
核酸提取試劑室溫保存（蛋白酶K需要放置-20℃保存），擴增反應(yīng)試劑置于-20℃保存。試劑盒有效期為12個月，避免反復(fù)凍融。
目錄號：JC1001
包裝規(guī)格：48次/盒
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組分 |
包裝 |
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核酸提取試劑 |
結(jié)合液CB |
11 mL |
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抑制物去除劑IR |
27 mL |
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漂洗液WB |
15 mL（第一次使用前請先在15ml漂洗液WB中加入60ml無水乙醇，充分混勻） |
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洗脫液EB |
15 mL |
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異丙醇 |
7 mL |
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蛋白酶K（20 mg/mL） |
20mg凍干粉 |
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吸附柱AC |
48個 |
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收集管（2mL） |
48個 |
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擴增反應(yīng)試劑 |
布氏桿菌熒光PCR引物探針Mix |
50 μL/2.0 mL棕色離心管 |
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布氏桿菌熒光PCR Premix |
500 μL/1.5 mL離心管 |
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陽性對照 |
250 μL/1.5 mL離心管 |
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陰性對照 |
250 μL/1.5 mL離心管 |
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滅菌水 |
200 μL/1.5 mL離心管 |
試劑盒組成
操作步驟
1、樣品前處理
1.1組織樣品：每份組織分別從3個不同的位置稱取樣品約1 g，手術(shù)剪剪碎混勻后取0.05 g于研磨器中研磨，加入1.5 mL生理鹽水后繼續(xù)研磨，待勻漿后轉(zhuǎn)至1.5mL滅菌離心管中，8000 rpm離心2 min，取上清液200 μL于1.5 mL滅菌離心管中；
1.2將拭子用無菌生理鹽水沾濕，收集陰道分泌物、流產(chǎn)物、陰莖分泌物、眼鼻分泌物樣品。再將拭子插入無菌生理鹽水（多余部分掰斷，蓋好蓋子），渦旋震蕩混勻，取上清200 μL于1.5 mL滅菌離心管中；
1.3精液、尿液、乳汁、關(guān)節(jié)炎和水囊瘤液直接取200 μL于1.5 mL滅菌離心管中。
2、 DNA提取
2.1上述1.5mL離心管中加入200 μL結(jié)合液CB，立刻劇烈顛倒輕搖充分混勻，再加入20 μL蛋白酶K (20 mg/mL)溶液（第一次使用蛋白酶K加入1mL滅菌水），充分混勻，70℃放置10 min。
2.2冷卻后加入100 μL異丙醇，劇烈顛倒輕搖充分混勻，此時可能會出現(xiàn)絮狀沉淀。
2.3將上一步所得溶液和絮狀沉淀都加入一個吸附柱AC中，（吸附柱放入收集管中）10,000 rpm離心30 s，倒掉收集管中的廢液（上述各步驟中適當(dāng)力度充分混勻非常重要，混勻不充分嚴(yán)重降低產(chǎn)量，必要時如樣品粘稠不易混勻時可以渦旋振蕩15s混勻）。
2.4加入500 μL抑制物去除劑IR，12,000 rpm 離心30 s，棄廢液。
2.5加入700 μL漂洗液WB（請先檢查是否已加入無水乙醇!），12,000 rpm 離心30 s，棄掉廢液。
2.6加入500 μL漂洗液WB，12,000 rpm 離心30 s，棄掉廢液。
2.7將吸附柱AC放回空收集管中，13,000 rpm離心2 min，盡量除去漂洗液，以免漂洗液中殘留乙醇抑制下游反應(yīng)。
2.8取出吸附柱AC，放入一個干凈的離心管中，在吸附膜的中間部位加50 μL洗脫緩沖液EB（洗脫緩沖液事先在 65-70℃水浴中預(yù)熱），室溫放置3-5 min，12,000 rpm 離心1 min。
2.9 DNA可以存放在2-8℃，如果要長時間存放，可以放置在-20℃。
3、 檢測步驟
3.1試劑的準(zhǔn)備
從試劑盒中取出擴增反應(yīng)試劑，冰上融化并振蕩混勻后，10,000 rpm離心10 s。
設(shè)所需要的PCR反應(yīng)管管數(shù)為N（N=樣本數(shù)+1管陰性對照+1管陽性對照），每個測試反應(yīng)體系配制如下表：
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試劑 |
每個反應(yīng)加入的量 |
N個反應(yīng)加入的量 |
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布氏桿菌熒光PCR引物探針Mix |
1 uL |
1×（N+1）μL |
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布氏桿菌熒光PCR Premix |
10 uL |
10×（N+1）μL |
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H2O |
4 uL |
4×（N+1）μL |
計算好各試劑的使用量，加入一適當(dāng)體積潔凈離心管中，充分混勻，10,000 rpm離心10 s，向設(shè)定的N個PCR反應(yīng)管中分別加入15 μL熒光PCR反應(yīng)液，向每管中加入處理后樣品/陰性對照/陽性對照5 μL，10,000rpm瞬時離心10秒。
3.1 qPCR 反應(yīng)循環(huán)條件設(shè)置
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步驟 |
循環(huán)數(shù) |
溫度 |
時間 |
熒光通道 |
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1 |
1 |
95 |
0:30 |
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2 |
40 |
95 |
0:5 |
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60 |
0:30 |
收集FAM熒光 |
4、 結(jié)果說明
4.1結(jié)果分析條件設(shè)定
讀取檢測結(jié)果?閾值設(shè)定原則以閾值線剛好超過正常陰性對照品擴增曲線的最高點，不同儀器可根據(jù)儀器噪音情況進行調(diào)整?
4.2試驗有效判定
陽性對照的Ct值應(yīng)小于30并出現(xiàn)特定擴增曲線?陰性對照無Ct值并且無特定擴增曲線。
4.3結(jié)果描述及判定
4.3.1 陰性判定
無 Ct 值并且無特定擴增曲線?
4.3.2 陽性判定
Ct 值≤35，且出現(xiàn)特定擴增曲線，樣本判定陽性?
4.3.3 可疑判定
對于Ct 值＞35的樣本，如沒有對數(shù)擴增曲線，則判為陰性；如有對數(shù)擴增曲線則判為可疑，可疑樣本建議重提核酸后再次擴增。重做結(jié)果如仍是可疑，則判為樣本陽性；否則判為陰性。
